免疫比浊中抗体的载体主要是胶乳微球,常见的胶乳微球由苯乙烯及相应功能单体通过乳液聚合法制得,粒径范围为50nm至400nm的一种纳米材料。胶乳微球的粒径会影响免疫比浊灵敏度大小、抗体投入量多少、包被微球的抗体活性及微球本身稳定性等,因此精准监控胶乳微球的粒径分布情况,团聚、分散等状态也成为微球的生产包被工艺流程中的重难点。
免疫比浊试剂的研发过程中,需要对裸露的胶乳微球进行包被以及封闭操作,而在微球包被、封闭结束后,通常需要通过高速离心的方法去除多余的蛋白和封闭剂,在离心之后又需要超声使微球均匀悬浮在液体当中。令人头疼的是,超声不足,微球不能充分分散;超声过度,可能造成抗体或封闭剂从微球表面脱落,容易造成微球聚集、沉淀。
微球颗粒越大、浓度越高吸光度也会增大,所以经常会用紫外分光光度法测量微球的吸光度来反应微球样本的团聚或者浓度情况。笔者通过紫外分光光度法研究了150nm微球包被前后的变化情况,检测了包被前的裸露150nm微球的吸光度为0.68A,包被后微球吸光度为1.11A,就说明包被后样本团聚严重。超声分散后,检测微球吸光度为0.60A,此时微球吸光度与裸微球的吸光度相近,说明微球已超声分散好,可以用于后续实验。
笔者选用了Nanocoulter检测微球包被过程中各步骤的颗粒浓度。数据显示150nm裸微球浓度为5.338E+11(Particles/mL),且粒径集中在150nm处,样本中只有微量团聚体,微球的均一性很好;包被后的微球,样本中的团聚明显增多,与吸光度反映一致;而包被微球超声后,浓度为4.602E+11(Particles/mL),相比裸微球,包被后超声微球浓度明显下降,样本损失了13.8%。而且超声后的微球并没有分散好,样本中还有10%左右的团聚颗粒。
至此,笔者确定先前引起吸光度降低的原因,就是因为工艺过程中微球的损失导致。另外,超声后吸光度虽降低,但微球中其实还是有部分团聚体,这种情况是分光光度计无法准确分析的。甚至因为损失,分光光度计还会在遇见团聚体时给出“分散较好”的误导信息!但实际上,微球吸光度一致时,微球的团聚情况也可能不同。
总结
纳米库尔特粒度仪(电阻法RPS)在免疫比浊试剂生产研发中有明显优势:
粒径测量媲美电镜,可以准确展示微球的粒径分布,分析团聚情况;
精准的浓度测量,分析微球包被工艺当中的损失及分散情况;